1.引言

心血管疾病（CVD）是老年人發病率高的慢性疾病，主要包括冠心病、腦血管病、高血壓、心力衰竭和風濕性心臟病。CVD是過早死亡和生活質量降低的主要原因，也是全球死亡的首要原因。作為心血管藥物，阿替洛爾（ATE）、美托洛爾（MET）、阿托伐他汀（ATO）和苯扎貝特（BZB）在地表水、河流的懸浮固體和沉積物中檢測到了這些藥物，表明它們在地表水環境中的濃度可能更高。此類污染物可能導致生物體的異常生理功能。因此，有必要探討心血管藥物對可能接觸這些藥物的水生生物發育和表觀遺傳狀態的影響。

在本研究中，斑馬魚被選為模型水生生物，以研究四種心血管藥物（ATE、MET、ATO和BZB）對斑馬魚早期發育的毒性。

2.實驗方法

根據斑馬魚早期的發育特點，選擇在受精后24-96小時期間每24小時觀察一次斑馬魚胚胎/幼魚。在受精后28小時，從每個實驗區隨機選擇三個胚胎，通過顯微鏡記錄視頻（1分鐘），進行自發運動分析，每個胚胎拍攝2-3個視頻。通過計算自發線圈收縮的頻率來確定運動頻率（受精后28小時）。在受精后48小時，從每個實驗區隨機選擇三個胚胎，記錄15–20秒的視頻（每個胚胎2–3個視頻），以測量心率。在受精后96小時，從每個實驗區隨機選擇三只幼魚來捕捉圖像，以測量身體長度和眼睛大小，使用諾達思的斑馬魚微視行為分析系統對這些視頻和圖像進行分析。此外，孵化率在受精后48-60時期間每2小時記錄一次，表示為孵化胚胎/暴露的胚胎總數。最后，從每個實驗區中隨機選擇2-3條斑馬魚（受精后120小時），利用諾達思斑馬魚行為軌跡跟蹤系統分析明暗循環下的自由泳活動。

3.實驗結果

3.1.四種心血管藥物對斑馬魚胚胎的發育毒性

3.1.1.自發運動和孵化

如圖1（A）所示，ATE、MET、ATO和BZB均抑制了斑魚胚胎的自發運動，在0.5–500μg·L-1的暴露濃度下，抑制率分別為3%–32%、2%–38%、14%–49%和15%–48%。ATO和BZB的作用強于ATE和MET。

如圖1（B）所示，BZB、ATO、ATE和MET以劑量依賴性的方式抑制了受精后54小時斑馬魚胚胎的孵化，在0.5–500μg·L-1的暴露濃度下，抑制率分別為10%–65%、17%–61%、4%–47%和4%–28%。

圖1

3.1.2斑馬魚胚胎的發育參數

如圖2所示，暴露于藥物的斑馬魚胚胎的死亡率與對照組之間沒有顯著差異（<10%）。在這四種藥物中，BZB對斑馬魚幼魚的生長表現出影響，而ATO對心率的影響最大。體長的減少表明，這些藥物導致斑馬魚幼魚發育遲緩。暴露于ATE、MET和BZB對斑馬魚的眼睛大小沒有影響，而ATO導致眼睛腫脹5%-15%（圖2（D））。

圖2

表1顯示了受精后96小時觀察到的斑馬魚胚胎的典型形態學變化。結果表明，所有藥物都會導致斑馬魚幼魚的異常發育，包括尾部畸形（TM）、卵黃囊水腫（YSE）、心包水腫（PE）和脊柱彎曲（BS）。在這些畸形中，YSE的發生率（0–17.3%）在所有組中最高。

表1

3.1.3自由游泳活動

剛孵出的幼魚通常是不活動的，或者只是偶爾以緩慢的速度短暫移動（持續幾秒鐘）。在本研究中，進行了60分鐘的光/暗期實驗，以探討ATE、MET、ATO和BZB對幼魚（受精后120小時）自由游泳活動的影響。如圖3所示，與光刺激相比，所有組中的幼魚在10分鐘的黑暗刺激下都更加活躍。在光照期間，暴露于這些藥物不會對斑馬魚幼魚的移動距離產生任何顯著影響，但會改變幼魚對黑暗刺激的反應。熄燈后，ATO、BZB、ATE和MET分別將斑馬魚幼魚的總移動距離（10分鐘）減少了14%–63%、0–43%、0–41%和9%–33%。此外，平均速度分別降低了20%-72%、11%-62%、5%-50%和5%-36%。

圖3

3.2.BZB的表觀遺傳毒性

發育毒性實驗結果表明，ATO和BZB的毒性大于ATE和MET。一些疾病與過氧化物對表觀遺傳調控的調節有關。因此，本研究關注BZB對斑馬魚的潛在表觀遺傳毒性。

3.2.1.BZB的生物累積

0.5和5μg·L-1 BZB未導致成年斑馬魚死亡，而50和500μg·L-1 BZB實驗組的死亡率分別為1.1%和2.2%。圖4（A）顯示了暴露于0.5、5、50和500μg·L-1 BZB 30天的斑馬魚組織中BZB的濃度。BZB在組織中的累積濃度隨著暴露濃度的增加而增加。在相同的暴露濃度下，BZB在肝臟（148–370 ng/g）中的累積濃度明顯高于腎臟（113–288 ng/g）、腸道（122–271 ng/g），鰓（110–245 ng/g）和大腦（96–236 ng/g）。作為一種脂質調節劑，BZB主要積聚在肝臟中，因為它是魚類儲存脂質和氧化脂肪酸的主要器官。如圖4（B）所示，30天凈化后，一些BZB殘留在肝臟（38–110 ng/g）、腎臟（28–80 ng/g）和大腦（18–74 ng/g）中，腸道（13–74 ng/g）和鰓（7–61 ng/g）。結果表明，BZB可以在斑馬魚的組織中長期積累。

圖4

3.2.2 BZB誘導組織中的全局DNA甲基化

BZB對斑馬魚組織GDM水平的影響如圖5所示。BZB的暴露導致斑馬魚大腦、鰓、腸、肝臟和腎臟GDM水平的劑量依賴性降低。低濃度（即0.5和5μg·L-1）的BZB暴露導致斑馬魚大腦GDM水平下降4.3%–6.4%，鰓GDM水平降低6.1%–6.7%，腸道GDM水平減少7.1%–14.6%，肝臟GDM水平升高2.0%–12.5%，腎臟GDM水平降低5.1%–10.5%。當暴露濃度分別為0.5和5μg·L-1時，這些組織中的GDM水平沒有顯著差異（p>0.05）。然而，當暴露濃度分別為50和500μg·L-1時，肝臟（27.7%–38.3%）GDM水平的下降明顯大于腎臟（17.4%–31.4%）、腸道（13.7%–29.1%）、大腦（11.4%–26.7%）和鰓（13.9%–22.1%）（p<0.05）。

圖5

3.2.3.BZB誘導的肝臟基因表達

如圖6所示，肝臟中PPARα、Dnmt1和p53的表達隨著暴露濃度的增加而上調。與對照組相比，暴露于50和500μg·L-1的BZB分別將PPARα的表達上調2.3倍和7.6倍，而低暴露濃度（0.5和5μg·L-1）不會造成任何顯著影響。與對照組相比，暴露于50和500μg·L-1的BZB分別導致Dnmt1表達增加1.8倍和3.5倍，而低暴露濃度未造成顯著影響。此外，暴露于5–500μg·L-1 BZB可將p53的表達上調2.9至4.8倍，而0.5μg·L-1 BZC則無明顯影響。長期暴露于較高濃度（50–500μg·L-1）的BZB可能會導致斑馬魚有肝癌發生的風險。

圖6

4.結論

對于四種藥物阿替洛爾（ATE）、美托洛爾（MET）、阿托伐他汀（ATO）和苯扎貝特（BZB）的研究結果表明，這些藥物均導致斑魚胚胎自發運動減少和孵化延遲，阿托伐他汀（ATO）和苯扎貝特（BZB）的抑制作用比阿替洛爾（ATE）和美托洛爾（MET）更強。藥物暴露會對斑馬魚幼魚造成亞致死毒性影響，如孵化率、體長和心率降低，阿托伐他汀（ATO）還導致幼魚眼睛腫脹5%-15%。在接觸藥物的幼魚中觀察到卵黃囊水腫、心包水腫、脊柱彎曲和尾部畸形，卵黃囊水腫是最常見的畸形。此外，藥物可以抑制自發運動和自由游泳活動。在暴露于0.5μg·L-1至500μg·L-1 苯扎貝特（BZB）的成年斑馬魚（4個月大）的肝臟、腎臟、腸道、鰓和大腦中觀察到苯扎貝特（BZB）的積累和全局DNA甲基化水平的降低。肝臟是苯扎貝特（BZB）積累和DNA低甲基化發生的主要器官。在肝臟中，還觀察到與脂質代謝（PPARα）、DNA甲基化（Dnmt1）和凋亡（p53）相關的基因過度表達。目前的研究結果表明，長期接觸低濃度的心血管藥物可能會對水生生態系統造成嚴重威脅。

參考文獻

Ping, S., Lin, W., Ming, R., He, Y., Yin, Y., & Ren, Y. (2022). Toxic effects of four cardiovascular drugs on the development and epigenetics of zebrafish (Danio rerio). Science of the Total Environment, 846, 157360.

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